СПИД остается серьезной проблемой общественного здравоохранения, так как более 35 миллионов человек во всем мире ВИЧ-1-инфицированных и новые инфекции продолжают на постоянной скоростью больше чем два миллиона в год. Антиретровирусная терапия (АРТ) эффективно контролирует виремии практически у всех больных ВИЧ-1 и частично восстанавливает первичную клетку - хозяина (CD4 + Т-клетки), но не устраняет ВИЧ-1 от латентно-инфицированных Т-клеток 1 , 2 . В латентно-инфицированных CD4 + Т - клеток, интегрированные провирусной ДНК копии сохраняются в неактивном состоянии, но может быть возобновлен для получения вируса к репликации , когда Т-клетки активируются, что приводит к быстрому реактивации вируса после прерывания антиретровирусной терапии 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Таким образом, большинство ВИЧ-1-инфицированных лиц, даже те , кто очень хорошо реагируют на АРТ, должны поддерживать на протяжении всей жизни АРТ в связи с сохранением ВИЧ-1-инфицированных пластовых ячеек. Во время латентного ВИЧ инфицированные клетки продуцируют мало или не вирусного белка, тем самым избегая вирусных цитопатический эффект , и уклонение от клиренса иммунной системы хозяина. Поскольку отдыхает CD4 + память Т-клеток отсека 9 считается наиболее видную латентно-инфицированного бассейн клеток, он является ключевым направлением исследований , направленных на искоренение скрытой инфекции ВИЧ-1.
Недавние усилия по искоренению ВИЧ-1 из этой популяции клеток использовали в первую очередь в «шок и убить подход, с обоснованием , что индуцирование реактивации ВИЧ в CD4 + памяти Т-клеток может вызвать уничтожение вируса-продуцирующих клеток путем цитолиза или принимающей иммунные ответы. Например, эпигенетические модификации структуры хроматина имеет решающее значение для установления вирусной реактивации. Следовательно, ингибирование гистондезацетилазы (HDAC) путем трихостатин A (TSA) и вориностат (SAHA) привела к реактивации латентного вируса в клеточных линиях 10 , 11 , 12 . Соответственно, другие HDACi, включая вориностат, вальпроевой кислоты, panobinostat и rombidepsin были протестированы ех естественных условиях и привели, в лучшем случае, к преходящее увеличение виремии 13 , 14 . Точно так же, протеинкиназы С - агонисты, могут сильнодействующий реактивировать ВИЧ либо по отдельности , либо в комбинации с HDACi 15 , 16 . Тем не менее, существует несколько ограничений такого подхода: (I) , поскольку значительная доля геномов ВИЧ в этом водоеме не являются функциональными, а не все интегрированные провируса может производить репликации компетентным вирусом 17 ; (II) общее число CD4 + Т - клеток реактивированных из состояния покоя CD4 + Т - клеток ВИЧ-1 водохранилищ, было обнаружено с помощью вирусных нарост анализов , чтобы быть намного меньше , чем количества клеток , инфицированных как обнаружено с помощью анализов на основе ПЦР, предполагая , что не все клетки внутри этого резервуара реактивируются 18 ; (III) цитотоксический Т - лимфоцит (CTL) иммунный ответ не является достаточно прочным , чтобы устранить Реактивированный инфицированные клетки 19 и (IV) неинфицированных Т-клетки не защищены от ВИЧ - инфекции и , следовательно , способных обеспечивать вирусный отскока.
Эти наблюдения указывают на то, что стратегия лечения ВИЧ-1 инфекции должна включать в себя методы , которые непосредственно устраняют провирусной генома от большинства ВИЧ-1-инфицированных клеток, в том числе CD4 + Т-клеток и защищают клетки от инфекции в будущем, практически без вреда к хозяину. Кластеризованные, регулярно interspaced, короткие палиндромные повторы (CRISPR) / CRISPR-ассоциированный 9 (cas9) нуклеазы имеет широкий утилита для редактирования генома в широком диапазоне организмов , включающих дрожжи, Drosophila , данио, C. Элеганс , и мышей, и применяется в широком диапазоне в естественных условиях и в пробирке исследований к заболеваний человека 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . Недавно мы изменили / системы CRISPR cas9 чтобы включить распознавание специфических последовательностей ДНК , расположенных в пределах ВИЧ-1 промотора , перекрывающей длинный концевой последовательности 5 (LTR) 25 , 26 . С помощью этой модифицированной системы, мы теперь демонстрируют иссечение интегрированных копий фрагмента провирусной ДНК из латентно ВИЧ-1-инфицированного человека линии Т-лимфоидных клеток, полностью исключая HDAC ингибированию вируса вызвало производство. Результаты целого генома секвенирования и биоинформатики всеобъемлющего анализа исключало генотоксичности провести ДНК клеток. Кроме того, мы обнаружили , что lentivirally доставляемого CRISPR / cas9 снижает репликацию вируса при инфекции ВИЧ-1 первичных культивированных CD4 + Т-клеток. Результаты указывают на этот подход как перспективный потенциальной терапевтической авеню к ликвидации ВИЧ-1 из резервуара Т - клеток пациентов принимающих, чтобы предотвратить СПИД повторного возникновения.
Результаты
Cas9 / gRNA ингибирует ВИЧ-1 реактивации латентного ВИЧ-1 в человеческих Т-клеток
Сначала мы тестировали способность нашей модифицированной системы редактирования гена CRISPR / cas9 для устранения ВИЧ-1 генома в человеческой клеточной линии Т-лимфоцитарный, 2D10 11 . Эти клетки укрывает интегрированные копии одного раунда ВИЧ-1 PNL4-3 , геном которого не хватает последовательностей , кодирующих большинство полипротеина Gag-Pol, но охватывает всю длину 5 и 3 LTR , и включает в себя ген , кодирующий белок - маркер зеленый флуоресцентный белок (GFP) , заменяя Nef белок в латентном состоянии ( рис. 1 , ). Таким образом, 2D10 является подходящей клеточной линией сначала установить чек , подтверждающий принцип ВИЧ-1 ликвидации из - за единого характера интегрированных провируса. Лечение клоновых 2D10 клеток , стабильно экспрессирующих cas9, но не gRNAs, с провоспалительными агентами , такими как форболмиристатацетата (РМА) и / или ингибитора HDAC трихостатин A (TSA) глубоко стимулирует ВИЧ-1 активность промотора, который приводит к образованию вирусных белков и GFP в более чем 90% обработанных клеток ( рис. 1В , левые панели), обеспечивая удобную модель клеточной культуры для изучения вирусной латентности и реактивации. Совместная экспрессия cas9 вместе с gRNAs А и В, соответственно , предназначены для целевой высоко консервативную последовательность среди всех вирусных изолятов , охватывающих U3 области ДКП нуклеотида -287 / -254 (gRNA А) и нт -146 / -113 (gRNA Б ) ( рис. 1А ) полностью устранен РМА / ТСА-индуцированной продукции GFP, что указывает на ингибирование экспрессии генов ВИЧ-1 в предварительно выбранной смешанной клональной популяции Т-клеток , экспрессирующих обе cas9 и gRNA плазмиды экспрессии ( рис. 1Б , правая панели ). Выражение gRNAs и cas9 было подтверждено RT-PCR и Вестерн - блоттинга, соответственно ( рис. 1C , D). Выражение ВИЧ-1 был полностью исключен из клеток , экспрессирующих как cas9 и плазмид экспрессии gRNA, показано с помощью проточной цитометрии обнаружения производства GFP с помощью выбранных случайным образом cas9-положительных клоновых клеток с или без gRNA выражения ( рис. S2A ). Кроме того , мы обнаружили , что производство GFP был фактически заблокирован во многих клонов , которые выражали только одну gRNA (А или В), до уровней , аналогичных тем , вызванное коэкспрессией А и В ( рис S2B. , Смотрите также . Рис S2A ), предполагая , что экспрессия либо gRNA в одной конфигурации может инициировать расщепление на обоих LTRs для достижения ликвидации провирусной ДНК.
23-03-2016 04:57
Россия, Кемеровская обл.
Недавние усилия по искоренению ВИЧ-1 из этой популяции клеток использовали в первую очередь в «шок и убить подход, с обоснованием , что индуцирование реактивации ВИЧ в CD4 + памяти Т-клеток может вызвать уничтожение вируса-продуцирующих клеток путем цитолиза или принимающей иммунные ответы. Например, эпигенетические модификации структуры хроматина имеет решающее значение для установления вирусной реактивации. Следовательно, ингибирование гистондезацетилазы (HDAC) путем трихостатин A (TSA) и вориностат (SAHA) привела к реактивации латентного вируса в клеточных линиях 10 , 11 , 12 . Соответственно, другие HDACi, включая вориностат, вальпроевой кислоты, panobinostat и rombidepsin были протестированы ех естественных условиях и привели, в лучшем случае, к преходящее увеличение виремии 13 , 14 . Точно так же, протеинкиназы С - агонисты, могут сильнодействующий реактивировать ВИЧ либо по отдельности , либо в комбинации с HDACi 15 , 16 . Тем не менее, существует несколько ограничений такого подхода: (I) , поскольку значительная доля геномов ВИЧ в этом водоеме не являются функциональными, а не все интегрированные провируса может производить репликации компетентным вирусом 17 ; (II) общее число CD4 + Т - клеток реактивированных из состояния покоя CD4 + Т - клеток ВИЧ-1 водохранилищ, было обнаружено с помощью вирусных нарост анализов , чтобы быть намного меньше , чем количества клеток , инфицированных как обнаружено с помощью анализов на основе ПЦР, предполагая , что не все клетки внутри этого резервуара реактивируются 18 ; (III) цитотоксический Т - лимфоцит (CTL) иммунный ответ не является достаточно прочным , чтобы устранить Реактивированный инфицированные клетки 19 и (IV) неинфицированных Т-клетки не защищены от ВИЧ - инфекции и , следовательно , способных обеспечивать вирусный отскока.
Эти наблюдения указывают на то, что стратегия лечения ВИЧ-1 инфекции должна включать в себя методы , которые непосредственно устраняют провирусной генома от большинства ВИЧ-1-инфицированных клеток, в том числе CD4 + Т-клеток и защищают клетки от инфекции в будущем, практически без вреда к хозяину. Кластеризованные, регулярно interspaced, короткие палиндромные повторы (CRISPR) / CRISPR-ассоциированный 9 (cas9) нуклеазы имеет широкий утилита для редактирования генома в широком диапазоне организмов , включающих дрожжи, Drosophila , данио, C. Элеганс , и мышей, и применяется в широком диапазоне в естественных условиях и в пробирке исследований к заболеваний человека 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . Недавно мы изменили / системы CRISPR cas9 чтобы включить распознавание специфических последовательностей ДНК , расположенных в пределах ВИЧ-1 промотора , перекрывающей длинный концевой последовательности 5 (LTR) 25 , 26 . С помощью этой модифицированной системы, мы теперь демонстрируют иссечение интегрированных копий фрагмента провирусной ДНК из латентно ВИЧ-1-инфицированного человека линии Т-лимфоидных клеток, полностью исключая HDAC ингибированию вируса вызвало производство. Результаты целого генома секвенирования и биоинформатики всеобъемлющего анализа исключало генотоксичности провести ДНК клеток. Кроме того, мы обнаружили , что lentivirally доставляемого CRISPR / cas9 снижает репликацию вируса при инфекции ВИЧ-1 первичных культивированных CD4 + Т-клеток. Результаты указывают на этот подход как перспективный потенциальной терапевтической авеню к ликвидации ВИЧ-1 из резервуара Т - клеток пациентов принимающих, чтобы предотвратить СПИД повторного возникновения.
Результаты
Cas9 / gRNA ингибирует ВИЧ-1 реактивации латентного ВИЧ-1 в человеческих Т-клеток
Сначала мы тестировали способность нашей модифицированной системы редактирования гена CRISPR / cas9 для устранения ВИЧ-1 генома в человеческой клеточной линии Т-лимфоцитарный, 2D10 11 . Эти клетки укрывает интегрированные копии одного раунда ВИЧ-1 PNL4-3 , геном которого не хватает последовательностей , кодирующих большинство полипротеина Gag-Pol, но охватывает всю длину 5 и 3 LTR , и включает в себя ген , кодирующий белок - маркер зеленый флуоресцентный белок (GFP) , заменяя Nef белок в латентном состоянии ( рис. 1 , ). Таким образом, 2D10 является подходящей клеточной линией сначала установить чек , подтверждающий принцип ВИЧ-1 ликвидации из - за единого характера интегрированных провируса. Лечение клоновых 2D10 клеток , стабильно экспрессирующих cas9, но не gRNAs, с провоспалительными агентами , такими как форболмиристатацетата (РМА) и / или ингибитора HDAC трихостатин A (TSA) глубоко стимулирует ВИЧ-1 активность промотора, который приводит к образованию вирусных белков и GFP в более чем 90% обработанных клеток ( рис. 1В , левые панели), обеспечивая удобную модель клеточной культуры для изучения вирусной латентности и реактивации. Совместная экспрессия cas9 вместе с gRNAs А и В, соответственно , предназначены для целевой высоко консервативную последовательность среди всех вирусных изолятов , охватывающих U3 области ДКП нуклеотида -287 / -254 (gRNA А) и нт -146 / -113 (gRNA Б ) ( рис. 1А ) полностью устранен РМА / ТСА-индуцированной продукции GFP, что указывает на ингибирование экспрессии генов ВИЧ-1 в предварительно выбранной смешанной клональной популяции Т-клеток , экспрессирующих обе cas9 и gRNA плазмиды экспрессии ( рис. 1Б , правая панели ). Выражение gRNAs и cas9 было подтверждено RT-PCR и Вестерн - блоттинга, соответственно ( рис. 1C , D). Выражение ВИЧ-1 был полностью исключен из клеток , экспрессирующих как cas9 и плазмид экспрессии gRNA, показано с помощью проточной цитометрии обнаружения производства GFP с помощью выбранных случайным образом cas9-положительных клоновых клеток с или без gRNA выражения ( рис. S2A ). Кроме того , мы обнаружили , что производство GFP был фактически заблокирован во многих клонов , которые выражали только одну gRNA (А или В), до уровней , аналогичных тем , вызванное коэкспрессией А и В ( рис S2B. , Смотрите также . Рис S2A ), предполагая , что экспрессия либо gRNA в одной конфигурации может инициировать расщепление на обоих LTRs для достижения ликвидации провирусной ДНК.
23-03-2016 04:57