Исскуственный белок поможет победить ВИЧ
Искуственный белок поможет победить ВИЧ
Сегодня уже существует ряд методов лечения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), которые позволяют перевести заболевание в хроническую форму и продлить жизнь зараженных людей. Имеющиеся препараты направлены против разных стадий жизненного цикла вируса - одни из них блокируют механизм проникновения вируса в клетку, другие выводят из строя вирусную обратную транскриптазу - фермент, при помощи которого вирус переписывает свою наследственную информацию в геном хозяйской клетки. Все эти методы, однако, не позволяют вылечить те клетки, в геном которых вирус уже успел переписаться. Пока в геноме зараженной клетки присутствует провирус (так называется копия вирусного генома, встроенная в хозяйский геном), вирус будет постоянно воскресать.
Германские ученые при помощи метода искусственной эволюции получили фермент, способный находить провирус ВИЧ в геноме клетки и вырезать его оттуда. За основу был взят белок Cre относящийся к классу так называемых сайт-специфичных рекомбиназ . Этот белок, широко применяемый биологами для различных манипуляций с ДНК, изначально был выделен из вируса-бактериофага P1. Белок Cre узнаёт две расположенные на некотором расстоянии друг от друга последовательности из 34 нуклеотидов и вырезает участок ДНК, расположенный между ними. Последовательность, распознаваемая белком Cre, получила название LoxP (locus of X-over P1)
У провируса ВИЧ на концах имеются особые последовательности-палиндромы, или обращенные повторы (так называемые long terminal repeats, LTR) — это характерная черта многих вирусов и мобильных генетических элементов, таких как транспозоны и ретротранспозоны. Ученые решили искусственно вывести такую разновидность белка Cre, которая вместо «родной» последовательности LoxP узнавала бы какой-то участок концевых повторов провируса ВИЧ.
Сначала в концевых повторах ВИЧ был найден участок, наиболее сходный с LoxP. Его назвали LoxLTR. Сходство оказалось довольно низким: совпадало лишь 17 нуклеотидов из 34. Исходный белок Cre наотрез отказался «признавать» эту последовательность. Не помогло и внесение в белок разнообразных небольших изменений (мутаций). Стало ясно, что для создания необходимого фермента в белок Cre должен быть внесен целый комплекс изменений, который невозможно угадать методом проб и ошибок — слишком много вариантов пришлось бы перебрать.
Тогда ученые решили расчленить задачу, оказавшуюся слишком сложной, на составные части, и решать их по отдельности. Для этого было изготовлено и внедрено в геном подопытного объекта (кишечной палочки) несколько модифицированных вариантов LoxLTR, более похожих на LoxP, чем исходная версия. «Задача» в данном случае — это 17 нуклеотидов, отличающих LoxLTR от LoxP, а «расчленение задачи» состояло в том, что каждый из модифицированных вариантов LoxLTR содержал лишь некоторые из этих 17 отличий, а в остальном был идентичен LoxP.
Теперь дело пошло лучше: для каждого из модифицированных вариантов LoxLTR удалось подобрать такие модификации Cre, которые хоть и с трудом, но всё же узнавали их. Так из различных вариантов белка Cre были отобраны «перспективные кандидаты». В них снова раз за разом вносили небольшие случайные изменения и проводили отбор на способность распознавать данную последовательность нуклеотидов. В результате были получены белки, уверенно и безошибочно распознающие тестируемые последовательности нуклеотидов (модифицированные LoxLTR) и вырезающие куски ДНК, расположенные между ними.
Последовательность LoxP, которую распознает исходный белок Cre, и наиболее похожий на нее участок в геноме ВИЧ (LoxLTR). Ниже показаны различные модификации последовательности LoxLTR, использованные в экспериментах по искусственной эволюции. Можно заметить, что последовательность LoxP, не считая центральных 8 нуклеотидов, представляет собой палиндром — левая часть комплементарна правой, прочтенной в обратном порядке. К таким последовательностям ДНК-связывающие белки (например, сайт-специфичные рекомбиназы) обычно прикрепляются по два, в виде димеров, как показано на рисунке. Последовательность LoxLTR не является палиндромом, что создало исследователям дополнительные трудности. Рис. из обсуждаемой статьи в Science Последовательность LoxP, которую распознает исходный белок Cre, и наиболее похожий на нее участок в геноме ВИЧ (LoxLTR). Ниже показаны различные модификации последовательности LoxLTR, использованные в экспериментах по искусственной эволюции. Можно заметить, что последовательность LoxP, не считая центральных 8 нуклеотидов, представляет собой палиндром — левая часть комплементарна правой, прочтенной в обратном порядке. К таким последовательностям ДНК-связывающие белки (например, сайт-специфичные рекомбиназы) обычно прикрепляются по два, в виде димеров, как показано на рисунке. Последовательность LoxLTR не является палиндромом, что создало исследователям дополнительные трудности.
Ни один из этих белков, однако, еще не мог распознать реальную последовательность LoxLTR — ту, которая присутствует в геноме ВИЧ. Каждый из них научился узнавать лишь отдельные признаки этой последовательности. Это произошло благодаря тому, что в каждом белке зафиксировались определенные полезные мутации — в каждом случае разные. Теперь нужно было объединить их все в одной белковой молекуле. Для этого ученые стали комбинировать фрагменты отобранных белков, и среди получившихся вариантов нашлись такие, которые с низкой эффективностью могли вырезать провирус ВИЧ из генома. Еще несколько циклов искусственной эволюции — и в распоряжении исследователей оказался новый белок, отлично справляющийся с поставленной задачей. Он получил название Tre. Новый фермент, как выяснилось, сильно отличается от своего прототипа — белка Cre. Замене подверглись целых 19 аминокислот.
Белок Tre протестировали не только на кишечной палочке, но и в культуре клеток человека, геном которых содержал провирус ВИЧ со встроенным геном светящегося белка. Свечение этих клеток сигнализировало о присутствии активного провируса. Когда в эти клетки был внедрен ген, кодирующий белок Tre, две трети клеток перестали светиться. Последующий анализ генома клеток подтвердил, что провирус был оттуда вырезан. Никаких вредных побочных эффектов выявлено не было.
Авторы признают, что их открытие едва ли будет использовано в медицинской практике в ближайшие годы. Непонятно, как доставить белок Tre в зараженные клетки и как при этом избежать побочных последствий, которые обязательно появятся на уровне целого организма — хотя их и не было на уровне отдельных клеток. Важность данной работы в том, что она открывает принципиально новый путь, новую стратегию в борьбе с ВИЧ.
Сегодня уже существует ряд методов лечения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), которые позволяют перевести заболевание в хроническую форму и продлить жизнь зараженных людей. Имеющиеся препараты направлены против разных стадий жизненного цикла вируса - одни из них блокируют механизм проникновения вируса в клетку, другие выводят из строя вирусную обратную транскриптазу - фермент, при помощи которого вирус переписывает свою наследственную информацию в геном хозяйской клетки. Все эти методы, однако, не позволяют вылечить те клетки, в геном которых вирус уже успел переписаться. Пока в геноме зараженной клетки присутствует провирус (так называется копия вирусного генома, встроенная в хозяйский геном), вирус будет постоянно воскресать.
Германские ученые при помощи метода искусственной эволюции получили фермент, способный находить провирус ВИЧ в геноме клетки и вырезать его оттуда. За основу был взят белок Cre относящийся к классу так называемых сайт-специфичных рекомбиназ . Этот белок, широко применяемый биологами для различных манипуляций с ДНК, изначально был выделен из вируса-бактериофага P1. Белок Cre узнаёт две расположенные на некотором расстоянии друг от друга последовательности из 34 нуклеотидов и вырезает участок ДНК, расположенный между ними. Последовательность, распознаваемая белком Cre, получила название LoxP (locus of X-over P1)
У провируса ВИЧ на концах имеются особые последовательности-палиндромы, или обращенные повторы (так называемые long terminal repeats, LTR) — это характерная черта многих вирусов и мобильных генетических элементов, таких как транспозоны и ретротранспозоны. Ученые решили искусственно вывести такую разновидность белка Cre, которая вместо «родной» последовательности LoxP узнавала бы какой-то участок концевых повторов провируса ВИЧ.
Сначала в концевых повторах ВИЧ был найден участок, наиболее сходный с LoxP. Его назвали LoxLTR. Сходство оказалось довольно низким: совпадало лишь 17 нуклеотидов из 34. Исходный белок Cre наотрез отказался «признавать» эту последовательность. Не помогло и внесение в белок разнообразных небольших изменений (мутаций). Стало ясно, что для создания необходимого фермента в белок Cre должен быть внесен целый комплекс изменений, который невозможно угадать методом проб и ошибок — слишком много вариантов пришлось бы перебрать.
Тогда ученые решили расчленить задачу, оказавшуюся слишком сложной, на составные части, и решать их по отдельности. Для этого было изготовлено и внедрено в геном подопытного объекта (кишечной палочки) несколько модифицированных вариантов LoxLTR, более похожих на LoxP, чем исходная версия. «Задача» в данном случае — это 17 нуклеотидов, отличающих LoxLTR от LoxP, а «расчленение задачи» состояло в том, что каждый из модифицированных вариантов LoxLTR содержал лишь некоторые из этих 17 отличий, а в остальном был идентичен LoxP.
Теперь дело пошло лучше: для каждого из модифицированных вариантов LoxLTR удалось подобрать такие модификации Cre, которые хоть и с трудом, но всё же узнавали их. Так из различных вариантов белка Cre были отобраны «перспективные кандидаты». В них снова раз за разом вносили небольшие случайные изменения и проводили отбор на способность распознавать данную последовательность нуклеотидов. В результате были получены белки, уверенно и безошибочно распознающие тестируемые последовательности нуклеотидов (модифицированные LoxLTR) и вырезающие куски ДНК, расположенные между ними.
Последовательность LoxP, которую распознает исходный белок Cre, и наиболее похожий на нее участок в геноме ВИЧ (LoxLTR). Ниже показаны различные модификации последовательности LoxLTR, использованные в экспериментах по искусственной эволюции. Можно заметить, что последовательность LoxP, не считая центральных 8 нуклеотидов, представляет собой палиндром — левая часть комплементарна правой, прочтенной в обратном порядке. К таким последовательностям ДНК-связывающие белки (например, сайт-специфичные рекомбиназы) обычно прикрепляются по два, в виде димеров, как показано на рисунке. Последовательность LoxLTR не является палиндромом, что создало исследователям дополнительные трудности. Рис. из обсуждаемой статьи в Science Последовательность LoxP, которую распознает исходный белок Cre, и наиболее похожий на нее участок в геноме ВИЧ (LoxLTR). Ниже показаны различные модификации последовательности LoxLTR, использованные в экспериментах по искусственной эволюции. Можно заметить, что последовательность LoxP, не считая центральных 8 нуклеотидов, представляет собой палиндром — левая часть комплементарна правой, прочтенной в обратном порядке. К таким последовательностям ДНК-связывающие белки (например, сайт-специфичные рекомбиназы) обычно прикрепляются по два, в виде димеров, как показано на рисунке. Последовательность LoxLTR не является палиндромом, что создало исследователям дополнительные трудности.
Ни один из этих белков, однако, еще не мог распознать реальную последовательность LoxLTR — ту, которая присутствует в геноме ВИЧ. Каждый из них научился узнавать лишь отдельные признаки этой последовательности. Это произошло благодаря тому, что в каждом белке зафиксировались определенные полезные мутации — в каждом случае разные. Теперь нужно было объединить их все в одной белковой молекуле. Для этого ученые стали комбинировать фрагменты отобранных белков, и среди получившихся вариантов нашлись такие, которые с низкой эффективностью могли вырезать провирус ВИЧ из генома. Еще несколько циклов искусственной эволюции — и в распоряжении исследователей оказался новый белок, отлично справляющийся с поставленной задачей. Он получил название Tre. Новый фермент, как выяснилось, сильно отличается от своего прототипа — белка Cre. Замене подверглись целых 19 аминокислот.
Белок Tre протестировали не только на кишечной палочке, но и в культуре клеток человека, геном которых содержал провирус ВИЧ со встроенным геном светящегося белка. Свечение этих клеток сигнализировало о присутствии активного провируса. Когда в эти клетки был внедрен ген, кодирующий белок Tre, две трети клеток перестали светиться. Последующий анализ генома клеток подтвердил, что провирус был оттуда вырезан. Никаких вредных побочных эффектов выявлено не было.
Авторы признают, что их открытие едва ли будет использовано в медицинской практике в ближайшие годы. Непонятно, как доставить белок Tre в зараженные клетки и как при этом избежать побочных последствий, которые обязательно появятся на уровне целого организма — хотя их и не было на уровне отдельных клеток. Важность данной работы в том, что она открывает принципиально новый путь, новую стратегию в борьбе с ВИЧ.
28-01-2008 04:21
Россия, Москва и Московская обл.
Каким же образом действует вирус, вызывающий СПИД? В отличие от всех других вирусов ВИЧ поражает иммунную систему человека, которая в обычных условиях оберегает организм от "незванных гостей". Разрушая иммунную систему, ВИЧ разоружает человеческий организм перед лицом атакующих его болезнетворных сил. ВИЧ обладает способностью не только разрушать клетки иммунной системы, но и "коллонизировать" их: он может вторгнуться в клетку и на какой-то период затаиться в ней, чтобы впоследствии активизироваться и подавить человеческий иммунитет.
Как же выглядит ВИЧ? Он представляет собой микроскопическую цепочку из девяти генов, упакованную в оболочку из протеина. Геном (то есть полный набор генов) ВИЧ примерно в 100 тысяч раз меньше, чем геном человека. Протеиновая упаковка вируса содержит в себе рецептор - такое устройство, которе позволяет вирусу приклеиваться к гораздо большей по величине клетке человека. Как только вирус приклеится к этой клетке (как правило, к иммунной клетке), он сбрасывает с себя протеиновую упаковку и проникает клетку.
Затем цепочка генов вируса врезается в генетический код ядра клетки и становится ее составной частью. Отсюда вирус дает клетке команды на воспроизводство себе подобных вирусов.
Наполнившись до предела новыми вирусами, клетка разбухает, лопается и выбрасывает порции новых вирусов, которые отправляются захватывать новые клетки. Иногда вирусные гены в течении ряда лет мирно спят в ядре клетки (так называемый латентный или скрытый период), а затем по неясной пока причине вдруг "просыпаются" и дают команду на воспроизводство себе подобных.
Даже в течение того периода, пока спящий вирус живет, затаившись в ядре клетки, иммунная система человека продолжает производить антитела, которые предназначены для распознавания и уничтожения вирусов. Но в этом случае вырабатываемые антитела оказываются обессиленными, неспособными бороться против вирусов.
28-01-2008 07:44